Caractérisation moléculaire des voies électroniques manquantes pour la synthèse du butanol chez Clostridium acetobutylicum

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4691 (2022) Citer cet article

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Clostridium acetobutylicum est un biocatalyseur prometteur pour la production renouvelable de n-butanol. Plusieurs stratégies métaboliques ont déjà été développées pour augmenter les rendements en butanol, le plus souvent basées sur la redirection de la voie du carbone. Cependant, il a déjà été démontré que les activités de la ferrédoxine-NADP+ réductase et de la ferrédoxine-NAD+ réductase, dont les gènes codants restent inconnus, sont nécessaires pour produire le NADPH et le NADH supplémentaire nécessaire à la synthèse du butanol dans des conditions solvantogènes. Ici, nous purifions, identifions et caractérisons partiellement les protéines responsables des deux activités et démontrons l'implication des enzymes identifiées dans la synthèse du butanol grâce à une approche génétique inverse. Nous démontrons en outre que le rendement de formation de butanol est limité par le niveau d’expression de CA_C0764, le gène codant pour la ferrédoxine-NADP+ réductase et l’opéron bcd, codant pour une ferrédoxine-NAD+ réductase. L'intégration de ces enzymes dans des stratégies d'ingénierie métabolique introduit des opportunités pour développer une souche homobutanologique de C. acetobutylicum.

Clostridium acetobutylicum est une bactérie anaérobie Gram positive sporulée, capable de convertir divers sucres et polysaccharides en acides organiques (acétate et butyrate) et solvants (acétone, butanol et éthanol). En raison de son importance dans la production industrielle des produits chimiques en vrac acétone et butanol1,2,3 et de son utilisation potentielle dans la production de n-butanol, un carburant liquide biosourcé prometteur présentant plusieurs avantages par rapport à l'éthanol4,5, de nombreuses recherches se sont concentrées sur ( i) comprendre la régulation de la formation de solvants6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 et (ii) modifier métaboliquement ce micro-organisme pour produire des rendements élevés d'alcools16,17,18.

En utilisant une approche de biologie systémique globale pour caractériser le métabolisme solvantogène d'une culture chimiostatique limitée en phosphate de C. acetobutylicum, les six étapes impliquées dans la conversion de l'acétyl-CoA en butanol (Fig. 1) ont été précédemment caractérisées19 : l'enzyme principale Il a été démontré que le complexe BCD (codé par bcd, etfB et etfA, l'opéron bcd), responsable de la réduction du crotonyl-CoA en butyryl-CoA, est une enzyme bifurquante consommant deux moles de NADH et produisant une mole de ferrédoxine réduite, et le Il a été démontré que les deux dernières étapes de la production de butanol étaient catalysées par AdhE1 via son activité aldéhyde déshydrogénase dépendante du NADH et par BdhB, BdhC et BdhA via leur activité butanol déshydrogénase dépendante du NADPH. Ces résultats ont eu un fort impact sur la distribution du flux électronique, car il a été démontré que les activités ferrédoxine-NADP+ réductase et ferrédoxine-NAD+ réductase étaient nécessaires pour produire le NADPH et le NADH supplémentaire nécessaire à la synthèse du butanol à partir de l'acétyl-CoA (Fig. 2). 19. Bien que les activités de ces enzymes aient déjà été détectées chez C. acetobutylicum6,20, les gènes codants restaient inconnus19,21. Les enzymes ferrédoxine-NADP+ réductase (FNOR) (EC 1.18.1.3) sont distribuées dans une variété d'organismes aérobies, des procaryotes aux eucaryotes, en particulier dans les plantes22, mais n'ont jamais été purifiées et caractérisées à partir d'aucune espèce clostridienne. En revanche, la réduction du NAD+ dépendante de la ferrédoxine couplée à l'exportation de protons (Rnf) et aux transhydrogénases dépendantes de la ferrédoxine (Nfn) ont été caractérisées d'un point de vue moléculaire chez plusieurs espèces de clostridiens, mais aucun homologue n'a été trouvé chez C. acetobutylicum23,24,25. De plus, il a été démontré que C. acetobutylicum était incapable de produire du NADPH par la voie oxydative du pentose-phosphate, car il manquait un gène codant pour une glucose-6-P déshydrogénase, la première et clé enzyme de cette voie.

La case verte indique les produits primaires dans des conditions acidogènes, tandis que la case rouge indique les produits primaires dans des conditions solvantogènes. Les lettres en rouge et en italique indiquent les gènes correspondants. ack acétate kinase, adc acétoacétate décarboxylase, adhE1 aldéhyde déshydrogénase, adhE2 bifonctionnelle aldéhyde/alcool déshydrogénase, alsD alpha-acétolactate décarboxylase, alsS acétolactate synthase, bcd butyryl-CoA déshydrogénase, bdh butanol déshydrogénase, buk butyrate kinase, crt crotonase, ctfAB CoA -transférase , flavoprotéine de transfert d'électrons etf, hbd 3-hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase, hydrogénase, fnor ferrédoxine-NAD(P)+ oxydoréductases, pdc pyruvate décarboxylase, pfor pyruvate : ferrédoxine oxydoréductase, pta phosphotransacétylase, ptb phosphotransbutyrylase, thl thiolase, gapC NADH-dépendant la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase non phosphorylante gapN produisant du NADPH, Fd ox représente la ferrédoxine oxydée, tandis que le Fd rouge représente la ferrédoxine réduite.